L'hyperactivation de LPA1 / 3 induit une hydrocéphalie post-hémorragique néonatale par perte épendymale et dysfonction ciliaire | Promotion limitée !

abstrait

L'hydrocéphalie postémorragique (PHH) chez les prématurés est un trouble neurologique commun traité par des interventions neurochirurgicales invasives. Les patients atteints de PHH manquent d'interventions thérapeutiques efficaces et souffrent de comorbidités chroniques. Nous rapportons ici un modèle post-natal de PHH induit par l'acide lysophosphatidique murin (LPA) qui cartographie le développement neurologique chez les prématurés, une population à haut risque accessible sur le plan clinique et une démonstration de ventriculomégalie avec augmentation de la pression intracrânienne. L'administration de LPA, un lipide de signalisation transmis par le sang, a interrompu de manière aiguë les cellules épendymaires génératrices du flux de liquide céphalo-rachidien, suivie de la mort cellulaire, d'une phagocytose et d'une dénudation de la surface ventriculaire. Ce mécanisme est différent d'un modèle fœtal précédemment rapporté qui induit la PHH par des altérations du développement. Analyse de souris à récepteur de LPA nul reconnues par le LPA1 et LPA3 comme médiateurs PHH clés. Blocage pharmacologique du LPA1 empêché la PHH chez les animaux ayant reçu une injection de LPA, soutenant la traitabilité médicale des antagonistes des récepteurs du LPA dans la prévention des séquelles négatives de la PHH et du SNC chez le prématuré.

INTRODUCTION

L’hydrocéphalie infantile est une affection neurologique courante qui touche environ 1 naissance sur 1 000 naissances vivantes (1). Elle se caractérise par une accumulation de liquide céphalo-rachidien (CSF), une hypertrophie des ventricules remplis de liquide (appelée "ventriculomégalie" (VM)), une augmentation de la pression intracrânienne (PIC), un amincissement cortical et une série de modifications neuroanatomiques et de déficits fonctionnels comorbides. L'hydrocéphalie peut avoir plusieurs causes – notamment des malformations du développement neurologique, une infection intraventriculaire ou une hémorragie (IVH) – et est particulièrement fréquente chez les prématurés présentant une vasculature cérébrale fragile (1, 2). Ces nourrissons, nés à moins de 37 semaines d’âge gestationnel (GA), courent un risque grave d’HIV et d’hydrocéphalie post-hémorragique ultérieure (PHH) (2). Environ 15 à 20% des prématurés présentant un faible poids à la naissance souffrent d’IVH et jusqu’à 25% d’entre eux développent une PHH progressive (2, 3), ce qui correspond à environ 5% des prématurés ou 4 nouveau-nés pour 10 000 naissances (4). Malgré la forte incidence de PHH, les traitements préventifs font actuellement défaut, une situation aggravée par le manque de modèles animaux adéquats qui récapitulent l'hydrocéphalie humaine à des stades de développement cliniquement pertinents.

Un médiateur possible de PHH est l'acide lysophosphatidique (LPA), un lipide de signalisation véhiculé par le sang avec six récepteurs connus de la protéine hétérotrimère GTP (GPCR), appelé LPA.1-LPA6 (5). Le LPA est produit par la lysophosphatidylcholine à partir de l'enzyme autotaxine et circule dans le sang au sein des plaquettes ou est lié à des protéines de transport telles que l'albumine (6). Les taux de LPA transmis dans le sang sont particulièrement importants en cas d’hémorragie ou de traumatisme (6). Par conséquent, une hémorragie grave introduirait de fortes concentrations de LPA dans le cerveau pendant une période prolongée. Les récepteurs LPA (LPAR) sont exprimés dans différents types de cellules du système nerveux central (SNC) et il a été signalé que la signalisation de la LPAR était responsable de multiples maladies neurologiques et inflammatoires (7). Par conséquent, il est raisonnable de prédire que des concentrations élevées de LPA après une IVH pourraient jouer un rôle dans l'initiation de l'HPH.

La première partition logique à être identifiée (LPA)1) (8) est exprimée dans la zone ventriculaire neuroproliférative, où elle peut affecter les cellules neuroprogénitales. Un rapport précédent avait montré que les cellules neuroprogénitales étaient interrompues par la libération de LPA par voie intraventriculaire dans un modèle murin de souris PHH (9). Bien que ce modèle récapitule de nombreuses comorbidités humaines, il est parallèle à un âge précoce du neurodéveloppement humain fœtal qui précède également les plus petits prématurés. Un modèle capable de produire fidèlement une hydrocéphalie à des âges équivalents à ceux observés chez l'homme prématuré de 22 à 34 semaines d'AG serait à la fois éclairant sur le plan mécanique et vital pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à prévenir ou atténuer les PHH néonatales. Par conséquent, nous avons traduit ce modèle PHH induit par le LPA chez des souris postnatales.

Ici, nous rapportons un nouveau modèle murin de PHH produit par la livraison intra-ventriculaire de LPA pendant la vie postnatale à un âge similaire à celui des nourrissons prématurés à risque de IVH. Ce modèle postnatal résume différentes caractéristiques cliniques de la PHH humaine (tableau 1) et implique une population cellulaire spécifique, l'épendyme de monocouche ciliée, qui recouvre le système ventriculaire et exprime la LPAR au cours de l'âge néonatal. Les cils épendymaux battent de manière synchrone pour distribuer le liquide céphalorachidien à partir des ventricules (10), où il est créé par le plexus choroïde (11), dans l’ensemble du SNC. La perturbation du développement ou de la fonction de ces cellules génère une hydrocéphalie spontanée (1214) et des couches épendymaires compromises ont été observés chez des patients humains présentant une hydrocéphalie (15, 16). Ce nouveau modèle prouve que l'interruption épendymale induite par la LPAR peut jouer un rôle clé pendant le début de l'HPH néonatale.

Tableau 1 Phénotypes cliniques de PHH résumés par ce modèle murin de souris induite par le LPA.

Les séquelles rapportées dans les études cliniques menées auprès de cohortes de patients hydrocéphaliques par rapport aux phénotypes observés dans ce modèle néonatal de PHH. L’IVH a été imité en injectant du LPA directement dans le ventricule latéral de souris postnatales au huitième jour (P8).

RÉSULTATS

L’exposition intraventriculaire du LPA induit une hydrocéphalie à haute pression chez la souris néonatale

Dans un modèle PHH fœtal, le LPA induit PHH lorsqu’il est injecté dans les ventricules de souris embryonnaires du jour 13.5 (E13.5).9), qui est liée à la fin du premier trimestre chez l'homme (Fig. 1A) (17, 18). Les interruptions qui en résultent ont des effets sur les cellules neuroprogénitrices mitotiques ou juste postmitotiques. Cependant, ce modèle prénatal de souris a accès à un stade de développement neurologique du fœtus comportant des options diagnostiques et thérapeutiques limitées. Par conséquent, nous avons traduit ce modèle pour résumer les PHH chez les prématurés, qui représentent une population cliniquement accessible et nécessiteuse. Les nourrissons prématurés souffrant d’hypertension artérielle intraveineuse, mais capables de survivre suffisamment longtemps pour développer une PHH, ont généralement un GA de 22 à 34 semaines, ce qui correspond aux souris néonatales aux jours postnatals 4 à 8 (P4 à P8) (17, 18).

Fig. 1 L'exposition intracérébrale au LPA induit une hydrocéphalie chez les souris néonatales.

(A) Corrélation approximative entre le développement du cerveau humain et de la souris, mettant en évidence la naissance à long terme (40 semaines contre P0; bleu) et l’âge au risque élevé d’HPH (20 à 34 semaines par rapport à P4 à P8 +; rouge). (B) Approche expérimentale pour ce modèle néonatal d’hydrocéphalie induite par le LPA. Les souris ont reçu l’injection intracrânienne stéréotaxique P8 (à gauche; le forceps indique la position approximative de l’injection), suivie de la mesure terminale ICP (centre) et de la collecte du cerveau 7 jours plus tard ("P8 + 7d "; droite). 21G, calibre 21. (C) L’injection intracérébrale de LPA produit de la VM. Des sections représentatives du cerveau de souris non injectées (Uninj), injectées à partir du véhicule (Veh) et de P8 + 7d injectées avec du LPA, quantifiées en (D). () Quantification de l'augmentation du volume du ventricule latéral (n = 10 par groupe expérimental). La ligne pointillée indique 2 ET au-dessus de la moyenne du véhicule. (et) ICP accru dans le cerveau de souris P8 + 7d injectées avec du LPA (n = 9) par rapport aux cerveaux non injectés (n = 8) ou injecté par le véhicule (n = 7) souris. (D et E) Les symboles indiquent les valeurs des souris individuelles. ****P <0,0001 et ***P <0,0005 par rapport aux commandes du véhicule. (fa) Courbe de survie de Kaplan-Meier sur une période de 12 semaines chez des souris non injectées et des souris ayant reçu une injection de véhicule ou de LPA à P8 (n = 7 non injecté, n = 9 véhicule e n = 11 LPA).

Nous avons observé des phénotypes pertinents pour PHH à chaque jour postnatal suivant l'injection de LPA, en particulier à P8, ce qui correspond à un âge néonatal humain approximatif lorsque les enfants ont une survie post-hémorragique plus élevée en plus d'un risque élevé. de PHH (Fig. 1A) (2). Les souris P8 présentaient également une létalité postopératoire plus faible; par conséquent, cet âge a été choisi pour une caractérisation plus poussée. Nous avons injecté par voie stéréotaxique des ratons de souris dans un ventricule latéral avec un véhicule (témoin) ou du LPA 112 μM, jusqu'à une concentration finale d'environ 18 μM dans le LCR (Fig. 1B; pour plus de détails sur la concentration en LPA, voir Matériels et méthodes et figure S1). Les animaux ont été euthanasiés 7 jours après l'injection ("P8 + 7d"). Les cerveaux ont ensuite été collectés et analysés pour déterminer les paramètres de PHH, y compris les VM et les anomalies histologiques. En particulier, les cerveaux ayant reçu une injection de LPA présentaient un volume ventriculaire plus de 10 fois supérieur à celui des ventricules latéraux injectés ou non injectés par le véhicule (Fig. 1, C et D). Nous avons observé cette VM «sévère» chez 100% des animaux ayant reçu une injection de LPA, accompagnée d'un amincissement cortical et d'une destruction du corps calleux. Avec P8, le crâne de la souris postnatale est fusionné; par conséquent, VM n'était pas accompagné d'expansion crânienne à P8 + 7d. En particulier, les PHH post-nataux induits par le LPA n'étaient pas associés à une croissance excessive et à l'occlusion de l'aqueduc rostral, ce qui est observé dans l'hydrocéphalie fœtale induite par le LPA (9), impliquant des mécanismes cellulaires distincts dans une forme de PHH non obstructive ou communicative.

PHH a deux principaux signes cliniques: augmentation de la VM et ICP. Alors que la VM est couramment rapportée dans des modèles animaux de PHH, aucune augmentation de la PIC n'a été rapportée chez la souris, ce qui reflète les difficultés techniques rencontrées pour évaluer ce paramètre chez les petits animaux. Nous avons donc développé un protocole pour mesurer la PIC chez les ratons de souris (Fig. 1B) en insérant un moniteur de pression à fibre optique dans le ventricule latéral de souris sous sédation. Les mesures de la pression des fibres optiques chez les souris ayant reçu une injection de LPA ont montré une ICP significativement accrue par rapport aux cohortes du véhicule non injectées et injectées (Fig. 1E).

Après avoir évalué les effets morphologiques aigus de l'hydrocéphalie induite par le LPA, nous avons donc testé la survie à long terme. Chez les animaux autorisés à survivre avec l'hydrocéphalie, plus de 80% sont morts dans les 12 semaines (11 semaines après l'injection) (Fig. 1F). Ces souris présentaient généralement un poids insuffisant et présentaient des postures incurvées et des manteaux non peignés. Ensemble, ces données démontrent que la PHH induite par le LPA est chronique, progressive et fatale sans intervention externe.

L'exposition au LPA induit un dysfonctionnement épendymal aigu

Pour observer les effets de l'injection de LPA sur différentes régions du cerveau et types de cellules en fonction du temps, nous avons recueilli les cerveaux de LPA injectés 3, 6 et 24 heures après la chirurgie. Les coupes ont été colorées avec H & E (hématoxyline et éosine) pour analyse histologique (Fig. 2, A et B). L'insulte initiale semblait toucher principalement l'épendyme, une monocouche de cellules ciliées qui tapisse le système ventriculaire du cerveau. Ces cellules agissent comme une barrière entre le liquide céphalo-rachidien et le parenchyme et leurs battements de cils produisent un écoulement de liquide céphalo-rachidien autour du cerveau (10, 11).

Fig.2 Le LPA influence l’intégrité épendymale.

(A) Images représentatives de ventricules latéraux colorés avec H & E 3, 6 et 24 heures après une exposition au LPA (grossissement, × 10) (n = 5). LV, ventricule latéral. (B) Régions élargies (× 63) des zones encadrées indiquées en (A). (C) Cils et corps cellulaires des cellules épendymales du ventricule latéral immunomarquées avec de la tubuline acétylée (AcTub) (vert, cils) et S100 (rouge, corps cellulaire) avec opposition nucléaire 4, n ° 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). Les flèches indiquent les sections dénudées de la paroi ventriculaire. () Quantification de la perte de cellules épendymales chez la souris P8 24 heures après l'injection de LPA (n = 8) ou un véhicule (n = 5). La zone d'immunomarquage S100 entourant les ventricules latéraux a été ajoutée sur cinq sections en série couvrant 1 mm de ventricule latéral, à l'aide d'ImageJ. Chaque symbole représente la fluorescence S100 ventriculaire totale d'un seul cerveau. ****P <0,0001 par rapport aux commandes du véhicule. (et) Image mono-image (× 20) d'un ventricule latéral coloré au Hoechst (bleu, noyaux), à la lectine DyLight 488 (verte, membrane épendymale) et à la CM-DiI (rouge, cils) prélevée sur l'imagerie ciliaire en direct montrée à fig. Film S2 et S1. (fa) Exemple d’analyse de suivi sur une seule image, avec des points colorés superposés sur les cils et des traces blanches qui tracent les motifs de la motilité ciliaire pendant 10 s, tirées du film S2. (sol) Quantification de la variation de la vitesse moyenne du mouvement ciliaire de 0 à 3 heures dans les puits traités avec des véhicules et du LPA (n = 3). Les symboles représentent les valeurs de coupe du cerveau des trois mêmes souris traitées au véhicule, 1 µM de LPA ou 10 µM de LPA. (D et G) *P <0,05 e **P <0,005 par rapport aux témoins du véhicule, tel que déterminé par l'analyse de variance (ANOVA) avec le test post-hoc de Tukey.

Les modifications de la membrane cellulaire épendymale et l'arrondissement nucléaire étaient évidents dans les 3 heures suivant l'injection de LPA et s'accompagnaient d'une perte d'adhérence de la membrane basale 6 heures après l'injection de LPA, suivie d'une épuisement substantiel de l'épendyme monocouche 24 heures après l'injection de LPA (Fig. 2B). Nous avons confirmé ces premières observations immunohistologiquement par coloration de la tubuline acétylée (AcTub) et de S100, marqueurs identifiant respectivement les cils épendymaux et les corps cellulaires (Fig. 2C). La santé ciliaire est diminuée parallèlement aux changements de morphologie cellulaire, comme en témoigne une perte d'immunoréactivité des cellules ciliaires, qui a diminué et disparu de 3 à 6 heures, tandis que les corps de cellules épendymaires (S100) ont été perdus dans les 24 heures. après exposition au LPA (Fig. 2C). La quantification de la perte de cellules épendymales à 24 heures, déterminée en mesurant la surface de fluorescence S100 entourant les ventricules latéraux, a mis en évidence un appauvrissement significatif induit par l'EPA induit par le LPA (Fig. 2D).

La rapidité des changements des cils épendymaux à 3 heures a entraîné des événements aigus encore plus précoces. Pour explorer cette possibilité, nous avons examiné les effets du LPA sur la fonction épendymaire en temps réel à l'aide d'un système de culture de tranches de cerveau associé à la visualisation à grande vitesse de la motilité ciliaire. Les tranches de cerveau vivant préparées en sectionnant le vibratome ont été marquées avec des colorants perméables à la membrane non toxiques pour permettre la visualisation par fluorescence des membranes épendymales et des cils sourciliers (Fig. 2E et Fig. S2). Les tranches ont été placées à l'intérieur d'une plaque de culture tissulaire de manière à pouvoir reproduire une paroi ventriculaire latérale pendant 10 secondes à 112,3 images / s (fps) pendant des intervalles de 30 minutes sur une période de 30 secondes. 6 heures (film S1). Après avoir acquis la motilité de base de chaque puits, un t = 0, les coupes ont été exposées à la solution du véhicule ou amenées à des concentrations finales de 1 ou 10 μM de LPA, puis affichées avec imagerie time-lapse. Nous avons traité des fichiers d’images dans Imaris pour retracer le mouvement ciliaire (Fig. 2F et film S2). La quantification a révélé une réduction de la vitesse de déplacement ciliaire liée à la dose de LPA 3 heures après l'exposition au LPA par rapport à la motilité ciliaire basale à t = 0 (Fig. 2G). Ces données confirment les perturbations de la motilité ciliaire dépendantes du LPA, qui se produisent rapidement après une exposition au LPA.

Les cils épendymaux dégénèrent et sont phagocytés

Les données ci-dessus démontrent une détérioration de la santé et de la fonction épendymale induite par le LPA, notamment une perte d'AcTub et une motilité ciliaire réduite, ce qui suggère que les modifications structurelles des cils épendymaires pourraient être liées à ces perturbations fonctionnelles. Il est connu que les sous-unités de α-tubuline sont acétylées (AcTub) pour construire l’axonème des microtubules, dans lequel deux singles du microtubule central sont couplés à neuf doublets externes de microtubules bien enrobés dans la membrane cellulaire (19). L'activité motrice entre ces structures sert à guider le battement ciliaire; par conséquent, la structure des axonèmes fait partie intégrante de la fonction ciliaire. Pour évaluer si les modifications de la structure ciliaire sont liées aux perturbations fonctionnelles observées, nous avons traité des échantillons à différents moments après l'injection de LPA ou de véhicule, en effectuant une microscopie électronique à balayage (SEM) et une microscopie électronique à transmission (TEM) sur la surface épendymaire. ciliata. La MET a révélé des interruptions morphologiques ciliaires induites par le LPA, notamment une perte fréquente de l'intégrité de la membrane et une distorsion occasionnelle de l'assonema des microtubules à 9 + 2 6 heures après l'injection (Fig. 3, de A à D). La SEM de la surface épendymale apicale a également révélé des touffes ciliaires, qui semblaient tordues et désorganisées, accompagnées d'une perte ciliaire progressive qui provoquait une surface ventriculaire irrégulière (Fig. 3, E et F). La surface ventriculaire était presque complètement épuisée en cils 24 heures après l'exposition au LPA (Fig. S3).

Fig. 3 La destruction épendymale précède l'infiltration immunitaire et la mort cellulaire.

(A pour ) Images TEM de coupes transversales de cils épendymaux. (A) touffe ciliaire avec plusieurs cils distincts adjacents à la membrane épendymale. (B) Membrane ciliaire et structure axonémique d'une souris injectée par un véhicule de type sauvage (WT). (C) Fracture de la membrane ciliaire et (D) axonème observée 6 heures après l'exposition au LPA. (et pour H) Images SEM de la surface ventriculaire. (E) Des surfaces épendymales ciliées intactes ont été observées dans les cerveaux exposés au véhicule. (F) Cerveau exposé au LPA avec perte ciliaire et présence de débris cellulaires. Les flèches bleues indiquent les touffes ciliaires restantes 6 heures après l'injection de LPA. (G) Cils exposés au véhicule 3 heures après l'injection. (H) Possible phagocyte observé 3 heures après l'exposition au LPA attaché à des cils épendymaux ratatinés et désorganisés. (Je et J) Images d'immunofluorescence de Iba1+ cellules immunitaires innées dans le ventricule latéral 6 heures après (I) véhicule ou (J) injection de LPA (× 10 avec insert × 63). (K) Nombre total de F4 / 80+ CD11b+ Ly6G macrophages et microglies isolés du cerveau de souris non injectées, injectés à partir de véhicules ou de LPA injecté 24 heures après l'injection, déterminés par cytométrie en flux. ****P <0,0001 par rapport aux commandes du véhicule. n = 5 cerveaux individuels combinés par deux expériences indépendantes. (L pour OU) Etiquetage final in situ plus (ISEL+) test indiquant des dommages à l'ADN 3 heures après l'injection (ADN fragmenté et brun; vert clair, noyaux). (L et M) Les cerveaux exposés au véhicule n'ont pas été affectés, tandis que l'exposition au LPA (N et O) a endommagé de manière sélective l'ADN épendymal, avec un grossissement (L et N) × 10 et des zones encadrées (M et O) agrandi à × 63. (P pour S) Caspase clivée 3 (Cas3) (rouge, avec contre-couleur nucléaire bleue) immunomarquée en (P et Q) injectée dans le véhicule et en (R et S) injectée dans le cerveau LPA, montrant une apoptose épendymaire sélective 6 heures après le Exposition au LPA. (P et R) Images agrandies x20 avec zones encadrées (Q et S) agrandies à 63 ×.

Les analyses SEM 3 et 6 heures après l'exposition au LPA ont également permis de capturer une population distincte de cellules à la surface ventriculaire de morphologie atypique (Fig. 3, G et H), ce qui pourrait indiquer le recrutement de cellules immunitaires phagocytaires. Pour déterminer si la localisation des cellules immunitaires a été modifiée après l'injection de LPA, l'immunofluorescence a été réalisée 6 heures après l'injection. Immunocoloration de la molécule 1 de l'adaptateur de calcium ionisé (Iba1), un marqueur de macrophages et de microglies, détecté par un résident Iba1+ cellules dans le plexus choroïde d'animaux injectés par le véhicule (Fig. 3I). L’exposition au LPA a entraîné une forte augmentation du nombre de cas d’Iba1+ cellules présentes à la surface ventriculaire (Fig. 3J), suggérant une migration des macrophages résidant dans le plexus choroïde ou provenant du sang vers la couche épendymale endommagée. Les analyses cytométriques en flux ont confirmé que le nombre total de F4 / 80+ Les macrophages et la microglie présents dans le cerveau 24 heures après l'injection étaient significativement plus élevés chez les animaux exposés au LPA que chez les témoins (Fig. 3K). Ces données indiquent que les cellules du système immunitaire inné sont recrutées en réponse à une lésion des cellules épendymales (20) et peuvent contribuer au développement de l'hydrocéphalie.

Les cellules épendymales subissent la mort cellulaire apoptotique dans les 24 heures suivant l'exposition au LPA

Le début de l'HPH est passé d'une insuffisance ciliaire aiguë à une perte cellulaire le long de la surface ventriculaire, indiquant que les voies de la mort cellulaire peuvent être activées dans les cellules épendymales en réponse à une exposition au LPA. Nous avons d’abord abordé cette possibilité en utilisant un étiquetage in situ (ISEL+) (21), une version plus sensible de la posologie finale du marquage au nickel désoxyribine triphosphate par la désoxyribidotransférase (TUNEL). Cette coloration identifiait la fragmentation de l'ADN 3 heures après l'exposition au LPA (Fig. 3, L à O). Pour déterminer si cette mort était initiée par les voies cellulaires de l'apoptose, nous avons évalué l'activation de la caspase par immunofluorescence de la caspase 3 clivée (Cas3) et détectée dans les cellules épendymales 6 heures après l'exposition au LPA (Fig. 3). , de P à S). Ensemble, ces données confirment la probabilité que le LPA induise des lésions épendymales, entraînant la mort cellulaire par apoptose, le recrutement de cellules immunitaires et, par la suite, la PHH (22, 23).

Les cellules épendymales expriment des gènes pour plusieurs sous-types de LPAR

Pour déterminer quels sous-types de LPAR pourraient être impliqués dans les changements épendymaux initiés par le LPA, nous avons utilisé la technologie RNAscope pour détecter les six gènes de LPAR, Lpar1-6, dans des sections de tissu P8. Nous avons observé en évidence LPAR1 expression et spécifique Lpar3 expression dans la monocouche épendymaire (Fig. 4, A et B), tandis que parl2, Lpar4, Lpar5, e Lpar6 son expression épendymale était faible ou non spécifique (fig. S4). Ces modèles d’expression sont distincts de ceux précédemment rapportés pour le cerveau foetal et adulte (24, 25), indiquant que les mécanismes dépendant de la partition logique pour la PHH peuvent impliquer des sous-types de récepteurs autres que ceux impliqués dans les modèles précédents.

Fig. 4 LPA1 et LPA3 sont impliqués dans le développement de l'hydrocéphalie.

L’expression spécifique de LPAR dans l’épendyme a été démontrée par RNAscope pour (A) LPAR1 et (B) Lpar3, (sondes d’ARN brunes avec contre-couleur nucléaire bleue). CP, plexus choroïde. (C) Du LPA a été injecté à des souris knock-out spécifiques à la LPAR et l'incidence de l'hydrocéphalie a été rapportée, telle que déterminée par l'analyse VM (n = 10 pour LPA1-LPA4 et n = 11 pour LPA5). () Quantification de la VM en LPA1 et LPA3 souris knock-out 7 jours après l'exposition du véhicule ou du LPA. WT, n = 5; nul n = 10. **P <0,01 et ****P <0,0001 par rapport aux animaux injectés par le véhicule WT. †P < 0,001 contre WT injecté avec du LPA. (et) Mesures ICP de LPA1souris -null comparées aux témoins de la litière et du véhicule 7 jours après l’injection. n = 7 chiots injectés par le véhicule, n = 21 portées injectées de LPA e n = 5 LPA injecté LPA1– / – chiots. **P <0,005 par rapport aux commandes du véhicule. (fa) VM quantifiée chez des souris traitées avec l’AM095 ou le véhicule 15 minutes avant l’injection de 500 µM de LPA dans 0,01% de sérum albumine (BSA). n = 9 non injecté, n = 5 véhicules, n = 10 LPA e n = 10 AM095 + LPA. *P <0,05 par rapport au véhicule témoin et †P <0,05 par rapport au WT injecté avec du LPA. (De D à F) Les symboles indiquent les valeurs des souris individuelles. Les lignes en pointillés indiquent 2 ET au-dessus de la moyenne du véhicule. (sol) Couleur épendimale AcTub (vert) et S100 (rouge) 24 heures après l'injection (grossissement × 10 avec inserts × 63). (H) Sections du ventricule latéral marquées par H et E 7 jours après l’injection. Les flèches indiquent les zones d'histologie interrompue.

Ces modèles d'expression du sous-type LPAR en fonction de l'âge suggèrent que la sensibilité à l'HPH induite par le LPA, ainsi que les types de cellules impliqués dans l'initiation et la progression de l'HPH, peut varier au cours de la vie. Cette hypothèse est corroborée par les divers effets de l’injection de LPA à différents âges de développement. Nous avons évalué la VM 7 jours après l'injection à différents âges. Une VM sévère a été observée chez 100% des animaux ayant reçu une injection à P4 ou à P8, mais seulement chez 50% des souris ayant reçu une injection à P14 et aucune VM significative (supérieure de 2 DS au-dessus du témoin) n'était détectable chez des souris adultes ayant reçu une injection de LPA ( figure S5). Ces résultats sont cohérents avec les modèles de développement de l'expression de la LPAR et sont corrélés à une expression réduite du sous-type de la LPAR dans l'épendyme ventriculaire vers la fin du développement neurologique (24, 25).

LPA1 et LPA3 ils sont des médiateurs clés de l'induction de PHH

L'exposition au LPA endommageait sélectivement les cellules épendymales avant le développement de l'hydrocéphalie dans le cerveau postnatal précoce. Combinées aux études d'hybridation in situ LPAR, ces données ont entraîné une hyperactivation sélective des récepteurs. Pour déterminer l’implication fonctionnelle des LPAR dans l’initiation de PHH, nous avons tenté d’induire PHH dans le LPA.1-LPA5 souris uniques et knock-out VM quantifiées à P8 + 7d. Alors que PHH a développé dans presque tous les LPA2, LPA4et LPA5 KO, seulement 40% de LPA1-null souris et 60% de LPA3-les souris ont développé une VM significative (Fig. 4, C et D). LPA concerné1-Les animaux nuls ont également présenté des VM moins graves comparés aux animaux ayant reçu une injection de LPA (WT) de type sauvage et de LPA avec injection de LPA1– / – la moyenne n'était pas significativement différente des témoins (Fig. 4D). En d'autres termes, non seulement il a fait moins de LPA1animaux -null ont des VM, mais ceux qui ont été les moins touchés. Ce LPA1 La protection contre le développement de PHH induite par knock-out ne dépendait pas du dimorphisme sexuel (fig. S5). LPA1 Les knock-outs qui ne développaient pas de VM avaient des niveaux ICP comparables à ceux des animaux WT et des animaux témoins hétérozygotes (Fig. 4E et Fig. S6). Ces résultats impliquent LPA1 et LPA3 la signalisation en tant que médiateurs de la VM et de la PHH induite par le LPA.

Comme élimination génétique du LPA1 ou LPA3 réduction de l'incidence et de la gravité de la VM, nous avons émis l'hypothèse que des interventions pharmacologiques pourraient également prévenir les PHH induites par le LPA. Deux antagonistes de LPAR ont été analysés pour déterminer les effets du bloc LPAR sur le développement de PHH: AM095, un LPA.1antagoniste sélectif (26) et Ki16425, un double LPA1 et LPA3 antagoniste (27). La quantité de LPA injectée a été réduite à une concentration inductive d'hydrocéphalie sous-maximale afin de mieux détecter les effets de AM095 et de Ki16425. Des injections intraventriculaires d'antagoniste (AM095 ou Ki16425 (1 mg / kg)) ont été suivies 15 minutes plus tard par du LPA délivré dans la même position. Après 7 jours, les cerveaux ont été collectés et la VM a été quantifiée (Fig. 4F). Les tentatives d'utilisation de Ki16425 ont impliqué 44% des animaux ne présentant pas de VM, mais cette réduction n'était pas statistiquement significative chez les témoins (Fig. S7). Ces différences peuvent refléter un problème de pharmacocinétique ou de dégradation du Ki16425. Par conséquent, nous avons reporté notre attention sur AM095.

Soixante-dix pour cent des animaux prétraités avec des véhicules et ayant reçu une injection de LPA présentaient une VM significative. En revanche, seulement 20% des animaux prétraités avec AM095 et ayant reçu une injection de LPA présentaient une VM (Fig. 4F). Ces résultats sont cohérents avec la sévérité réduite de la VM démontrée par le LPA1souris noires (Fig. 4D). Bloc LPA1 rapport par prétraitement AM095 ou utilisation de LPA1souris -null ont empêché les dommages épendymaux induits par le LPA en 24 heures, comme démontré immunohistochimiquement par coloration AcTub et S100 (Fig. 4G). Sept jours après l'exposition LPA, LPA1-null, LPA3-null et les animaux traités avec AM095 ont montré une augmentation significative du nombre d'animaux avec une histologie ventriculaire et corticale normale (Fig. 4, D, F et H). Ces données soutiennent l'utilisation de LPA1 antagonistes des paradigmes de prévention de la PHH induite par le LPA (Fig. 5).

Fig. 5 Mécanisme proposé pour la signalisation de la partition logique dans l'hydrocéphalie postnatale.

Suite à un événement hémorragique grave, le LPA est libéré dans le liquide céphalorachidien. LPA se lie au LPA1 et LPA3 récepteurs sur les cellules épendymales qui tapissent les ventricules, provoquant une stimulation excessive du GPCR. Après 6 heures, ces événements de signalisation provoquent l'apoptose des cellules épendymales, entraînant un dysfonctionnement ciliaire et le recrutement de phagocytes. L'exposition au LPA produit une perte significative de cellules épendymales après 24 heures. En l'absence de flux de cils, le LCR s'accumule dans l'espace ventriculaire, entraînant une VM et une hydrocéphalie chronique. Ces événements peuvent être évités avec la suppression génétique de LPA1 ou LPA3 ou par inhibition pharmacologique du LPA1 avec l’antagoniste sélectif AM095, démontrant que cet effet se produit par l’activation de LPAR spécifiques.

DISCUSSION

Ce rapport décrit la caractérisation d'un nouveau modèle murin de PHH généré par l'exposition intraventriculaire au LPA au cours de la première vie postnatale. Il utilise un mécanisme cliniquement admirable, la signalisation LPAR, à un âge pertinent du point de vue clinique: les souris P8, qui approchent les bébés prématurés dans des unités de soins intensifs néonatals présentant un risque élevé d'HIV et de PHH. Questo modello murino ha replicato molteplici aspetti del PHH riportati nell&#39;uomo, inclusi ICP e VM elevati (Tabella 1 e Fig. 1). L&#39;esposizione di LPA all&#39;interno dei ventricoli cerebrali, che si verifica probabilmente durante l&#39;emorragia intracranica umana, LPA a cellule ependimali iperattivate1 e, in misura minore, LPA3, con conseguente disfunzione ciliare e ridotta motilità insieme a danno, morte e rimozione delle cellule ependimali. Ciò è coerente con i modelli clinici e genetici di PHH, che dimostrano che la riduzione del flusso CSF ​​guidato da ciglia o la rimozione della barriera del parenchima CSF è sufficiente per causare l&#39;accumulo di CSF (1214), portando a VM e idrocefalo cronico (10, 11). Il nostro modello postnatale ha ricapitolato questi fenotipi sia in vivo, producendo PHH cronico indotto da LPA, sia ex vivo, dimostrando una riduzione mediata da LPA della motilità ciliare (Fig. 2). Questa perdita ependimale di cellule, VM e PHH potrebbe essere prevenuta in misura significativa da LPA1 rimozione o blocco e, in misura minore, da LPA3 rimozione (figure 4 e 5).

Questi dati sono tra i primi a modellare l&#39;idrocefalo nei topi in un&#39;età che corrisponde neurobiologicamente alle età dei neonati umani prematuri a rischio di PHH, vale a dire GA da 22 a 34 settimane (1, 17). Il modello di PHH postnatale riportato qui, che ha risposto all&#39;esposizione di LPA in una fase di sviluppo dopo che la neurogenesi è cessata all&#39;interno della corteccia cerebrale e l&#39;eminenza gangliare soggiacente, implica effetti intrinseci delle cellule ependimali. Questo meccanismo è fondamentalmente distinto da un modello fetale di idrocefalo indotto da LPA, in cui l&#39;esposizione a LPA ha influenzato la migrazione e il destino di LPA mitotico e postmitotico precoce1-esprimere le cellule progenitrici neurali (NPC) e alla fine ha portato ad alcuni effetti ependimali (9, 28). Entrambi i modelli producono idrocefalo con penetranza del 100%, ma il modello fetale manifesta alterazioni nel destino di NPC che riducono la generazione di cellule ependimali e inducono la stenosi acqueduttale, mentre il nuovo modello postnatale ha influenzato direttamente le cellule ependimali, causando disfunzione, morte e rimozione nella assenza di blocchi fisici CSF. Questa è una differenza fondamentale, poiché il modello neonatale può fare luce sui casi comunicanti o idiopatici di idrocefalo.

L&#39;importanza della degenerazione ependimale nell&#39;inizio del PHH indotto da LPA conferma la precedente letteratura sull&#39;idrocefalo (1214). Numerosi studi hanno dimostrato che le mutazioni genetiche che interrompono la funzione ciliare o perturbano lo sviluppo ependimale inducono spesso idrocefalo spontaneo. Ad esempio, la cancellazione di SNX27 è stato dimostrato che interrompe lo sviluppo ependimale e la ciliogenesi (12); una mutazione in Hydin causa difetti assonemici strutturali che riducono la flessione ciliare (14) e una mutazione della proteina ciliare ependimale CCDC39 induce anomalie strutturali e riduzione del flusso di CSF guidato dalle ciglia (13). Tutti e tre i modelli hanno alti tassi di idrocefalo spontaneo. Qui, identifichiamo la segnalazione LPA come mediatore chiave del PHH che influenza l&#39;integrità ciliare ed ependimale, coerente con questi altri modelli.

Per caratterizzare maggiormente l&#39;idrocefalo nei modelli murini, abbiamo sviluppato un metodo innovativo per misurare l&#39;ICP. L&#39;ICP elevata è un importante segno clinico del PHH che è difficile da misurare nei piccoli animali. Di conseguenza, la VM viene comunemente utilizzata come proxy per l&#39;idrocefalo. Questa circostanza lascia aperta la questione se i modelli animali producano effettivamente un aumento della ICP o se questi modelli inducano perdite cellulari che possono causare VM in assenza di idrocefalo ad alta pressione. Abbiamo monitorato l&#39;ICP nei primi topi postnatali usando un sottile cavo a pressione in fibra ottica, emulando approcci clinici. To our knowledge, this new postnatal model is the first to demonstrate increased ICP in mice beyond the more common end point of VM alone. The use of this model and ICP-measuring technique should allow more accurate assessment of PHH-related variables, including effects of candidate therapeutics.

The complete penetrance of intraventricular LPA exposure in producing postnatal hydrocephalus is notable. The CNS damage and severity of hydrocephalus followed a general dose response, whereby higher concentrations of LPA produced more pronounced PHH sequelae, particularly the degree of VM (fig. S5). Higher concentrations of LPA would be expected to access more LPARs and activate more LPAR subtypes. This may, in part, explain the incomplete rescue of LPA1-null and/or LPA3-null mutants, the rare rescue of other receptor subtype null mutants, and the variable pharmacological inhibition by Ki16425 or AM095. Further modification of this model to use reduced LPA dosing in combination with physiologically relevant carrier molecules, such as albumin, may allow more robust identification of new medical interventions. In addition to LPAR subtypes, pharmacological interventions could target downstream signaling pathways such as GPCR kinase 2, which inhibits LPA1 activation in neural cells (29); Rho/ROCK, which may influence ependymal adhesion or induce cytoskeletal changes affecting ependymal cilia (30); or apoptotic pathways suggested by cleaved Cas3 activity (31), to further elucidate mechanistic and therapeutic insights for neonatal PHH.

The dysfunction observed in our PHH model was progressive in nature, ultimately leading to the death and removal of ciliated ependymal cells. Examination at multiple time points delineated temporal stages of ependymal damage, raising questions about which stages might be therapeutically tractable. The effects of LPA exposure on ciliary motility were detected rapidly, as demonstrated in living slice cultures, and manifested as reductions in ciliary movement speed. Within hours in vivo, we observed significant ciliary changes that included membrane and axoneme disruption, followed by cell death and removal (Figs. 2 and 3).

It is possible that some aspects of ciliary dysfunction might be reversible. In this regard, a notable feature of this new postnatal model was the increase in innate immune cells observed through several methods. SEM showed cells possibly engulfing cilia within 3 hours following LPA injection; Iba1 immunofluorescence demonstrated recruitment to the ependymal surface 6 hours after LPA exposure, and the number of innate immune cells in the brain was quantifiably increased 24 hours following LPA injection, as determined by flow cytometry, supporting the possibility of macrophage and microglial involvement in PHH (Fig. 3). It is conceivable that ependymal cell death and ciliary loss might be prevented or reversed, in part, by the reduction of innate immune cell infiltration. However, clinical anti-inflammatory therapeutic interventions have shown equivocal results (2, 32), so further study is necessary to determine the role of this observed immune component in PHH progression.

LPA1 and LPA3 signaling pathways are promising targets for pharmacological intervention, since these receptors are members of a family of transmembrane GPCRs that are already candidates for many human medicines (33). In addition, multiple LPAR antagonists are under development for medical indications including fibrosis and cancer (34). The superior efficacy of the LPA1 inhibitor AM095 in preventing LPA-induced VM supports further development of LPAR antagonists with improved pharmacokinetic profiles for use in model systems and future clinical trials. Considering that IVH is observed in 15 to 20% of premature infants (2, 3), a case may be made for a prevention trial in the most susceptible infants at increased risk during the earliest GAs. Further characterization of our neonatal PHH model could reveal novel medical interventions to reduce PHH sequelae and circumvent the need for neurosurgical interventions.

MATERIALS AND METHODS

Experimental design

The objective of this study was to develop a PHH model targeting neonatal ages. We hypothesized that LPA would induce hydrocephalus at different ages, dependent on the LPAR-expressing cellular populations. For example, LPA might generate occlusions by stimulating residual neuroprogenitors or increasing CSF production through the choroid plexus. However, after beginning the study, we realized that the ventricular ependyma expresses high levels of LPARs at early postnatal ages and modified our hypotheses to determine how LPA affects this specific cellular population at several time points after injection.

This study used animals from C57BL/6J and Balb/c backgrounds along with several knockout variants. All procedures were conducted in accordance with Institutional Animal Care and Use Committee guidelines of The Scripps Research Institute and the Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Animals were treated with vehicle or LPA injected directly into the lateral ventricle, monitored before euthanasia, and brains were then harvested at several time points for histological and immunohistochemical analysis. Quantitative end points included VM by ventricular volume quantification, CSF accumulation by ICP measurements, and ependymal cell retention by quantification of the area of S100 fluorescent cell bodies.

Mice were randomly assigned treatments within each litter, and each experiment had littermate controls. Treatment and genotype identity were blinded from quantitative procedures. For VM quantification, images were acquired, and treatment identity was removed before processing. For ICP measurements, mice were assigned a number by tail-marking with no identifying treatment information, and genotypes were processed after data acquisition and animal euthanasia. S100 quantifications were run through an ImageJ macro that treated all samples identically.

As this study induced hydrocephalus with 100% incidence in LPA-treated animals, experiments could be conducted with high confidence and low error expectations. Therefore, sample size was selected to equal or exceed five individual animals per experiment. Multiple litters were used to obtain the required sample size for each experimental finding; therefore, each experiment was replicated at least once. The ex vivo brain slice experiment used three individual littermate brains for analysis. All findings were reproducible as reported, with PHH occurring in 100% of injected WT animals. Results did not change on the basis of time performed, litter variations, use of foster mothers, mouse strain, individual’s sex, a particular LPA or vehicle stock, or any other assessed parameters.

Data collection end points included tissue harvest at several time points after injection. These time points were selected on the basis of morphological and immunohistochemical changes at each stage, starting 7 days after injection when hydrocephalus is highly apparent. Brains were sectioned to sample the entire lateral ventricle system of the brain at 100-μm intervals for VM quantification, without exclusions. For immunohistochemical applications, brains were sectioned every 200 μm to capture the lateral ventricles on a single slide. For pressure measurements, at least 10 data points were acquired from each individual mouse for analysis. Additional data collection details and statistical analyses can be found in the methods below. No data points or outliers were excluded from quantifications.

Animal models

P8 littermates of C57BL/6J and Balb/c background were used for this study. No differences in PHH development were observed between strains (fig. S5). Lpar1-5 knockout mice (3539) were crossed onto C57BL/6J (LPA2, LPA4, and LPA5) or Balb/c (LPA1, LPA2, and LPA3) backgrounds. Pups were fostered with WT mothers when the birth mothers demonstrated aggression or knockout mothers could not leave the breeding colony.

LPA preparation and concentration

In anticipation of an expected 97% loss between LPA reconstitution and injection, resulting from lipid interactions with pipettes, tubes, and syringe surfaces in the absence of lipid carrier proteins, the following protocol was developed to achieve a final injection concentration of LPA equivalent to 112 μM (fig. S1). Powdered 18:1 LPA (857130P, Avanti Polar Lipids) was dissolved in methanol, then aliquoted into low-retention tubes, vacuum-dried, and stored at −20°C. LPA was reconstituted by sonicating in Hanks’ balanced salt solution (HBSS; 14175-095, Gibco) for a 5 mM stock. Five microliters of this stock was administered intracranially. Following calculated losses and on the basis of an estimated CSF volume of 24.4 μl, this 112 μM injection concentration resulted in a working concentration of 18 μM in CSF or 1.8 μM in the whole brain. Control animals were injected with 5 μl of vehicle. P8 CSF and brain volumes were estimated on the basis of mathematical extrapolation of data presented by Chuang et al. (40).

For the final inhibitor experiment, powdered LPA was reconstituted in 0.1% fatty acid–free bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS), aliquoted, and diluted to a 500 μM LPA stock in 0.01% BSA before injection. This resulted in an approximate concentration of 80 μM in CSF or 8 μM in whole brain. No losses were included in these calculations, as BSA significantly enhances LPA availability in aqueous solution.

Chirurgia

P8 pups were immobilized on a stereotactic frame using a custom head rest and sedated with either intraperitoneally administered Nembutal (40 mg/kg) or gaseous isoflurane. The skin atop the head was opened 0.5 cm from the bregma, and the needle was inserted through the skull at approximately 3.2 mm caudal by 0.7 mm lateral by 1.2 mm deep. Mice were injected into the right lateral ventricle with 5 μl of vehicle (HBSS) or 18:1 LPA using a 35- to 36-gauge needle and a glass 10-μl NanoFil syringe (World Precision Instruments). Postoperative flunixin meglumine (1 mg/kg; 0061-0851-03, Merck) was administered subcutaneously for 2 days for pain management, and mice were monitored daily until tissue harvest.

Pharmacology

To study the efficacy of pharmacological LPAR antagonists AM095 and Ki16425, we diluted the concentration of LPA to 10% (500 μM LPA in the stock tube) and added a carrier protein, 0.01% BSA, to the LPA and drug solutions, as BSA increases the solubility and bioavailability of LPA, Ki16425, and AM095 in solution (6). This LPA formulation was used for all LPAR inhibitor experiments, including Fig. 4F and fig. S7. Mice were pretreated with an intracranial injection of a 2.5-μl solution containing AM095 (1 mg/kg) (4 mM; HY-16029, MedChem), Ki16425 (1 mg/kg) (4 mM; 355025-24-0, Cayman Chemical), or vehicle (PBS with 0.01% BSA and 5% dimethyl sulfoxide) 15 min before injection at the same location with 5 μl of 18:1 LPA in PBS with 0.01% BSA.

Histology and microscopy

Whole brains were harvested from experimental animals at the time points indicated. For paraffin-embedded sections, brains were fixed in formalin acid alcohol (4% formaldehyde and 5% glacial acetic acid in 70% ethanol), paraffinized in a Tissue-Tek VIP, and embedded with a Tissue-Tek TEC. For frozen sections, tissues were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS, cryoprotected with 10 and 20% sucrose in PBS, and embedded in optimal cutting temperature compound (4583, Tissue-Tek) or Neg-50 (6502, Thermo Fisher Scientific). Sections were cut to a 10-μm thickness on a Leica microtome or cryostat.

A ZEISS Imager.M2 was used to obtain all images. For bright-field imaging, brain sections were deparaffinized and rehydrated through xylene and ethanol washes, stained with H&E, dehydrated in ethanol and xylenes, and then coverslipped and preserved with dibutylphthalate polystyrene xylene mounting media. Electron microscopy was performed at The Scripps Research Institute Core Microscopy Facility with a Philips CM100 TEM and Hitachi S4800 SEM, with tissue processing, sectioning, and imaging performed with the core staff.

For immunohistochemical analyses, deparaffinized or frozen sections were washed in tris-buffered saline (TBS) (pH 7.4), blocked in TBST (0.1% Triton X-100 in TBS) with 5% normal goat serum (NGS), and incubated with primary antibody in TBST with 1% NGS overnight at the dilutions listed below. After washing in TBST, sections were incubated with secondary antibody diluted 1:1000 in TBST for 1 hour and then washed sequentially in TBST, TBST with 1:10,000 4′,6-diamidino-2-phenylindole nuclear counterstain, and TBS. Slides were coverslipped with VECTASHIELD (H-1000, Vector Laboratories) and kept at 4°C until imaging. Antibodies used were S100A/B (1:300; NB200-538, Novus Biologicals) on paraffinized tissue, AcTub (1:250; T6793, Sigma-Aldrich) on paraffinized tissue, cleaved Cas3 (1:200; #9664, Cell Signaling Technology) on frozen tissue, and Iba1 (1:250; 019-19741, Wako) on frozen tissue. ISEL+ was performed on paraffinized tissue with the 2.5 brown detection kit (322310, Advanced Cell Diagnostics) and horseradish peroxidase labeling (Vector ImmPRESS, MP-7401) as per the manufacturer’s instructions.

VM quantification

Lateral ventricle volume was measured in coronal sections collected every 100 μm from the most anterior to posterior sections containing lateral ventricle. The ventricular area of each section was quantified in Adobe Photoshop CS6. The wand, quick selection, and lasso tools were used to individually select the left and right ventricular openings. In instances where ventricles were joined, a <5-pixel line was drawn down the midline of the brain to bisect the ventricles. Choroid plexus was included during quantification, as the free-floating nature of this organ causes it to occupy inconsistent locations in the ventricle. All ventricular areas were then summed and multiplied by 100 μm to create a volume approximation.

ICP recording

A BIOPAC Systems fiber-optic pressure cable was inserted through the barrel of a 21-gauge needle with a filed-down bevel. The sensor was wetted and calibrated in ultrapure water before each use. Pressure recordings were taken by retracting the sensor into the needle barrel, puncturing the skull of a heavily sedated mouse, and extending the pressure probe into the lateral ventricle. The probe was allowed to equilibrate for 5 s before recording every fifth measurement from the Opsens control panel. A total of at least 10 measurements were obtained and averaged together for each individual. To prevent fluid escape and pressure release during recording, the edge of the needle was sealed around the skull with putty or wax. After recording, the probe was carefully withdrawn, the mouse was euthanized, and brain tissue was collected.

Brain slice culture for live imaging

Brains were collected from two to three P8 animals, kept in iced HBSS with bubbled oxygen, and cut into 250-μm sections with a Leica VT1000 S vibratome. Sections containing lateral ventricle were incubated in high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) at 37°C for 5 min with membrane-permeable dyes: Hoechst nuclear stain (5 μg/ml) (H3570, Invitrogen), Lectin DyLight 488 (5 μg/ml) (DL-1174, Vector Laboratories) for ependymal and vascular staining, and Vybrant CM-DiI (5 μg/ml) (V22888, Invitrogen). CM-DiI was used to nonspecifically label cell membranes; however, ependymal cilia had higher staining intensities than other cellular membranes, likely because of their surface area and direct exposure to solution. Following two 3-min washes in DMEM, brains were transferred to a glass-bottomed 12-well plate (P12G-1.5-14-F, MatTek) containing 1 ml of high-glucose DMEM and weighed down with harp slice grids (HSG-5BD MEA, ALA Scientific). Sections were incubated for 1 hour to induce adhesion before imaging on a Nikon N-SIM with an A1R confocal scanner and equipped with a plate-heating chamber. This microscope has a resonance scanner that acquires simultaneous images at 405-, 488-, and 568-nm wavelengths. By performing a band scan, we were able to capture 10-s time-lapse images at 113.2 fps, which allows for visualization of ciliary beating. These videos were analyzed with Imaris to track the movement of CM-DiI–stained cilia. Points were excluded for colocalization with Hoechst or Lectin 488, restricted by frame-to-frame distance to track the back-and-forth movement of cilia, and filtered by tracking duration to prevent quantification of cilia beating out of frame. Tracking analysis video was exported at 23 fps (1/5 speed).

Brain immune cell isolation and quantification

Twenty-four hours after injection with vehicle or LPA into P8 mouse ventricles (P8+1d), animals were perfused with PBS, and brains were harvested. The Miltenyi gentleMACS Octo dissociator was used to create single-cell suspensions from whole brains. Immune cells were then isolated by a discontinuous Percoll (17-0891-02, GE Healthcare) gradient before fixation in 0.1% paraformaldehyde. Cells were incubated with anti-CD16/32 (Fc receptor block; 14-0161, eBioscience) before staining in Brilliant Stain Buffer Plus (566385, BD Biosciences (BD)) with antibody cocktail to identify macrophages and activated microglia (CD45+CD11b+/hiF4/80+Ly6G). Antibodies were purchased from either BD or eBioscience and were as follows: CD45-BV711 (30-F11, BD), CD11b-BV510 (M1/70, BD), F4/80-AF488 (BM8, eBioscience), and Ly6G-PE-Cy7 (1A8, eBioscience). Liquid counting beads (BD) were added immediately before data were obtained on a BD FACSAria Fusion flow cytometer and analyzed using FlowJo v10.4 software (Tree Star Inc.).

Statistical analysis

Statistical analyses were performed in GraphPad Prism 7.0. By setting the upper and lower limits of the 95% confidence interval based on the vehicle values, equivalence testing determined that uninjected and vehicle-injected cohorts were experimentally equivalent; therefore, comparisons to control groups were reported as P values determined between the means of experimental and vehicle-treated control cohorts. Tests between a single experimental group and a control were performed by unpaired two-tailed t test. Unless noted otherwise in the figure legend, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni’s multiple comparison test was used to determine differences between the means of multiple experimental groups. Dot plots report means (center bar) and SEM (error bars). Dotted lines indicate 2 SDs above the vehicle or control mean. la fa test was used to determine whether sample variances were equal. Survival comparisons were made using the Wilcoxon test and reported as a Kaplan-Meier graph.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/10/eaax2011/DC1

Fig. S1. LPA losses during sample preparation.

Fig. S2. Live ciliary tracking.

Fig. S3. SEM cilia coverage of the ventricular surface.

Fig. S4. LPAR RNA expression in the ventricular region.

Fig. S5. Dependence of LPA-induced PHH on age, sex, strain, and injection concentration.

Fig. S6. Data from Fig. 5E analyzed by genotype subgroup and PHH distribution for LPA1-null pressure measurements.

Fig. S7. LPAR antagonist efficacy for PHH prevention.

Movie S1. Real-time video of live ciliary beating.

Movie S2. Example of ciliary tracking analysis.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is pas for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank T. Shimizu for the gift of the LPA4-null mice; D. Jones, L. Wolszon, R. Rivera, and G. Kaeser for editing; R. Rivera for maintaining the mouse colony; and J. Nhan, M. Merete, and A. Cerda for quantification assistance. Funding: This work was supported through NIH NS084398 (J.C.), NIH MH051699 (J.C.), DOD W81XWH-17-1-0455 (J.C.), NIH T32GM007752 (N.C.L. and A.J.F.), AHA 16SDG27020014 (V.A.B.), NIH HL141880 (V.A.B.), and NIH NS103940 (Y.K.). Author contributions: J.C. conceived the project, oversaw experiments, and wrote the paper. N.C.L. planned and performed experiments, analyzed data, and wrote the paper. P.S.-P., A.J.F., Y.K., and V.A.B. performed experiments and analyzed data. G.K. performed histological work for the project. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors. All knockout mouse strains require material transfer agreement approval to obtain.

L'hyperactivation de LPA1 / 3 induit une hydrocéphalie post-hémorragique néonatale par perte épendymale et dysfonction ciliaire | Promotion limitée !
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